Києво-Могилянський колегіум постав у 1632 році внаслідок об’єднання Київської братської школи і школи Києво-Печерської лаври та увійшов в історію Києво-Могилянської академії як другий етап її розвитку. Петро Могила в сані архімандрита Києво-Печерської лаври, виконуючи заповіт першого ректора Київської Братської школи Йова Борецького щодо підтримки школи на Подолі, вступив до Київського братства, отримав титул старшого братчика, покровителя і фундатора Київського Братського колегіуму (згодом Києво-Могилянського колегіуму). Для потреб колегіуму та монастиря Петро Могила побудував одну з перших кам’яних споруд КМА – трапезну з церквою Св. Гліба і Бориса, де в тому числі відбувалося навчання, проходили диспути та зберігалася перша бібліотека. Офіційне затвердження колегіум отримав у 1635 році від польського короля Владислава IV Вази. Колегіум став не просто формальним об’єднанням двох шкіл, а фактично новим навчальним закладом, побудованим за моделлю єзуїтських колегіумів, які були найбільш прогресивними осередками освіти в Європі у XVII ст. Крім того, для забезпечення високого рівня викладання Петро Могила за свій кошт скеровував майбутніх викладачів колегіуму на навчання до західноєвропейських університетів і академій. Основною мовою навчання була латина, яка в той час виконувала функцію мови міжнародного спілкування в науці, юриспруденції та політичному житті.
Програма навчання включала так звані школи (класи або курси) – фара, інфима, граматика, синтаксима, поетика, риторика, логіка і діалектика. Перші чотири класи давали загальну гуманітарну освіту, в класі поетики навчали мистецтву віршування, в класі риторики – теорії і практики ораторського мистецтва.Клас філософії, окрім логіки і діалектики, включав природничі науки – фізику, математику, астрономію, зоологію. Згодом в колегіумі був запроваджений університетський курс філософії, який у 1646-1647 навчальному році започаткував ректор і професор колегіуму Інокентій Гізель, написавши для студентів підручник з філософії «Opus totius philosophiae» («Твір про всю філософію»). Окрім латинської в колегіумі викладалися давньоукраїнська, церковнослов’янська, грецька і польська мови. Характерними для навчального процесу в колегіумі були диспути, які носили публічний характер. Колегіум, продовжуючи традиції своєї попередниці – Києво-Братської школи, був всестановим закладом та без вікових обмежень.
Завдяки подарунку Петра Могили колегіум мав одну з найбільших бібліотек свого часу, яка включала понад 2 000 вітчизняних і західноєвропейських видань. Києво-Могилянський колегіум сприяв зростанню кількості освічених людей, учителів початкових шкіл, “мандрованих спудеїв” – учителів. Завдяки високому рівню навчання вихованці колегіуму продовжували студії в університетах Кракова, Гейдельбергу, Кенігсбергу, Лейпцига, Падуї, Риму, Парижа, Відня. Колегіум очолював ректор, який одночасно був ігуменом Київського Братського Богоявленського монастиря. Ректорами колегіуму були знані в свій час богослови і філософи, зокрема, Ісая Трофимович-Козловський (1632-1638 рр.), Софронія Почаський (1638-1640), Ігнатій Оксенович Старушич, Йосиф Кононович Горбацький (1640-1642), Інокентій Гізель (1648-1650).
Відповідно до Гадяцького договору 1658 року між Гетьманщиною та Річчю Посполитою Києво-Могилянському колегіуму надавався статус академії – вищого навчального закладу, тобто він отримував такі самі права, які мала Краківська академія – тогочасний Ягеллонський університет. Після загарбання українських земель Московським царством статус вищої школи і титул «академія» за Києво-Могилянською академією був офіційно визнаний грамотами російських царів у 1694 році та у 1701 році.